徐　洋,郝贵杰,沈锦玉

 ( 浙江省淡水水产研究所,浙江　湖州　313001 )

摘　要: 通过载体定量试验对四羟甲基硫酸磷( THPS) 、溴硝醇(BNP) 和甲醛溶液的杀菌效果进行测定。果表明,THPS 对于嗜水气单胞菌BSK210 菌株的平均杀灭率在浓度为0. 500μl/ L 时,在THPS与消毒剂接触5 min 内即100 %被杀灭。而甲醛溶液浓度为0. 500μl/ L 时同样接触5 min 杀灭率未达100 %; THPS 对于爱德华氏菌Et 菌株的平均杀灭率与菌株BSK210 相近; 而对于哈维氏弧菌GYC110821 株的平均杀灭率在浓度为1. 00μl/ L 时,在菌与消毒剂接触5 min 内即100 %被杀灭。而甲醛溶液浓度为0. 500μl/ L 时同样接触5 min 杀灭率未达100 %。BNP 对于菌株BSK210 的平均杀灭率在浓度为16 mg/ L 时,在菌与消毒剂接触5 min 内即100 %被杀灭;而对于菌株GYC110821 的平均杀灭率在浓度为8 mg/ L 时,在菌与消毒剂接触5 min 内即100 %被杀灭;BNP 对于菌株Et的平均杀灭率与菌株GYC110821 相近。试验表明THPS 相对BNP 和甲醛溶液的杀菌效果好,鉴于甲醛溶液本身对水体和水生动物的有害影响,可采用四羟甲基硫酸磷取代甲醛溶液。

关键词:四羟甲基硫酸磷;溴硝醇;甲醛溶液;载体定量试验

　　近年来,随着水产养殖业的发展,水产病害也日益猖獗。而细菌性疾病占了很大一部分,主要有:出血病、赤皮病、烂鳃病、黑鳃病、肠炎病、虾红腿病以及细菌性败血症等。其致病菌主要有嗜水气单胞菌( A eromonas hy d rop hi l a) 、爱德华菌( Ed2w ardsiel l a) 、黏球菌(My x ococcus pisciocol a) 、假单胞菌( Pseu domonas) 等。一般认为,这些疾病在水质恶化、温度条件适宜等情况下才会发生,要从根本上解决水产病害问题,必须进一步推行健康养殖模式,坚持“以防为主、防治结合”的原则,加强养殖生产管理,保护养殖水域环境,水产养殖病害防治重点是要做好细菌性病害的防治。因此消毒剂的使用极为关键。福尔马林常作为消毒剂使用,但是福尔马林会消耗水中的氧气并伤害到鱼类的鳃组织,会使鱼的黏液、表皮蛋白质凝固,因此,泼洒浓度过高,对鱼的鳃、体表均有危害。其药效与使用时的温度、环境有关,水温23～26 ℃时,对日本鳗鲡( A ng ui l l a j a ponica) 48 h 最大安全浓度为56×1026 ,一般实际使用时泼洒30 ×1026 是无害的,但水温超过28 ℃时,对池水中浮游生物有杀灭作用,易引起水质变坏。福尔马林对海水无脊椎生物也会造成强烈的毒害。在工厂化养殖中,福尔马林同样会对过滤系统中的硝化作用会产生不良影响。鉴于福尔马林的诸多不良影响,寻找相应的替代物就显得极为重要。

1 　材料与方法

1. 1 　消毒剂

四羟甲基硫酸磷( THPS 批号为20071110) ,购自湖北黄梅联兴化工有限责任公司;

溴硝醇(BNP)  江苏省太仓市浦源化工有限公司;

福尔马林   江医药化试药店。

1. 2 　试验菌

选用淡水鱼类细菌性败血症病原嗜水气单胞菌菌株BSK210 、爱德华氏菌菌株Et 、哈维氏弧菌(V . harvey i) 菌株GYC110821 (海水鱼致病菌) (本实验室分离、鉴定) 接种于普通肉汤培养液中,28 ℃培养20～24 h 的菌悬液,其中哈维氏弧菌的培养基含1.5%NaCl 。

1. 3 　培养基

含0.5%NaCl及1.5%NaCl 的肉汁胨培养基。

1. 4 　中和剂

0.5%%硫代硫酸钠+ 1%卵磷脂+1%吐温280的PBS 溶液。

1. 5 　稀释液

0.03mol/L pH7.2的PBS 溶液。

1. 6 　细菌悬液的制备

参照文献,无菌操作打开干燥菌种管,将菌种转接到营养肉汤中,置28 ℃培养18～24 h 。用接种环取培养的菌落,划线接种于营养琼脂培养基平板上,28 ℃培养18～24 h 。用接种环取一部分菌种接种于液体培养基中,在摇床内培养18～24 h ,制成菌悬液,用分光光度计测其OD560或OD550 。细菌浓度计算公式, 淡水菌: ( 18. 7587 ×OD560 -0. 7334) ×108 ×稀释倍数; 海水菌: ( 30. 173 ×OD550 - 2. 0046) ×108 ×稀释倍数,然后以稀释液稀释至所需使用的浓度1 ×108cfu/ml。

1. 7 　菌片的制备程序

消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体为10 mm ×10 mm 滤纸。将经灭菌的滤纸片平铺于无菌平皿内,逐片滴加菌液,滴加量为10μl/ 片,染菌载体置温箱内37 ℃烤干(约20～30 min) 。回收菌数即每个菌片的染菌量,将制备好的菌片放入含5 ml 中和剂的小三角烧瓶内,中和10 min ,充分振荡2 min ,以洗脱液的原液接种平板,培养24 h 进行活菌计数所得结果,应为5×105～5 ×106 cfu/片。

1. 8 　载体定量试验

将消毒液稀释至测试浓度(阳性对照PBS) ,将4 片菌片放入含5 ml 消毒剂的无菌平皿内,试验温度28℃,作用1 、5 、10 、20 min 时间,取出菌片,放入含5 ml 中和剂的小三角烧瓶内,中和10 min ,充分振荡2 min ,以洗脱菌片上的细菌。以洗脱液的原液接种平板,培养24 h 进行活菌计数,试验反复3次,计算平均杀灭率。

杀灭率/ %= 对照组存活菌数一试验组存活菌数对照组存活菌数×100%

2 　结果

2. 1 　THPS 对细菌的载体定量试验结果

THPS 不同时间段内对3 种病原菌的平均杀灭率见表1 。

表1 　                不同时间对3 种病原菌的平均杀灭率%

菌种	THPS μl.L-1	不同时间的平均杀灭率
		1 min	5 min	10 min	20 min
BSK210	0.500	99.19	100.00	100.00	100.00
	0.250	92.15	98.18	100.00	100.00
	0.125	70.15	88. 15	99. 99	100.00
Et	0.500	90.00	100.00	100.00	100.00
	0.250	88.65	98.54	100.00	100.00
	0.125	55.14	92.32	99.99	100.00
GYC110821	1.00	90.35	98.88	100.00	100.00
	0.500	89.00	92.14	100.00	100.00
	0.25	62.78	90.16	100.00	100.00

 

2. 2 　BNP 对细菌的载体定量试验结果

BNP 不同时间段内对3 种病原菌的平均杀灭率见表2 。

表2 　             BNP 不同时间对3 种病原菌的平均杀灭率%

菌种	BNP μl.L-1	不同时间的平均杀灭率
		1 min	5 min	10 min	20 min
BSK210	16	99.54	100.00	100.00	100.00
	8	92.15	98.18	100.00	100.00
	4	62.14	73.18	99.99	99.99
Et	8	99.72	100.00	100.00	100.00
	4	78.65	98.54	99.99	100.00
	2	45.14	97.32	99.99	99.99
GYC110821	8	99.54	100.00	100.00	100.00
	4	89.00	97.14	99.99	99.99
	2	62.78	94.16	99.18	99.99

2. 3 　甲醛溶液对细菌的载体定量试验结果

甲醛不同时间段内对3 种病原菌的平均杀灭率见表3 。

表3 　             甲醛溶液不同时间对3 种病原菌的平均杀灭率%

菌种	甲醛溶液 μl.L-1	不同时间的平均杀灭率
		1 min	5 min	10 min	20 min
BSK210	0.500	98.12	99.20	100.00	100.00
Et	0.500	89.72	94.00	100.00	100.00
GYC110821	1.000	89.38	96.10	100.00	100.00

3 　结论

由表1 、表2 可知, 消毒剂THPS 对于菌株BSK210 的平均杀灭率浓度为0.500μl/L时,在菌与消毒剂接触5 min 内即100 %被杀灭。而甲醛溶液浓度为0.500μl/L时同样接触5min 杀灭率未达100 %; THPS 对于菌株Et 的平均杀灭率与菌株BSK210 的能力相近;而对于菌株GYC110821 的平均杀灭率浓度为1.00μl/L 时,在菌与消毒剂接触5min内即100%被杀灭。而甲醛溶液浓度为0.500μl/L 时同样接触5min ,杀灭率却未达100 %。消毒剂BNP对于菌株BSK210 的平均杀灭率浓度为16mg/L时,在菌与消毒剂接触5min内即100 %被杀灭;而对于菌株GYC110821的平均杀灭率浓度为8 mg/L时,在菌与消毒剂接触5min内即100%被杀灭;BNP 对于菌株Et的平均杀灭率与菌株GYC110821 的能力相近。本试验表明THPS 较BNP 和甲醛溶液的杀菌效果好,鉴于甲醛溶液本身对水体和水生动物的有害影响,可采用四羟甲基硫酸磷取代甲醛溶液。

四羟甲基硫酸磷是一种绿色环保型季磷盐杀菌剂,产品水溶性好,凝固点低,化学性质稳定,且长时间储存不影响其质量。具有广谱、低毒、低剂量、低发泡性、对细菌及藻类具有较强的杀灭性能。1995 年获美国EPA 批准,认定其毒性分类为零,并被授予美国绿色化学奖。

消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体应根据消毒对象选择,常用的有金属、玻璃、滤纸、线、布等。根据其特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形,大小10 mm ×10 mm。当以金属片为载体时,因方形金属载体在振敲时易将玻璃试管撞碎,故改用直径12 mm 圆形金属片。所用载体(除滤纸片外) 于染菌前,应进行脱脂处理。脱脂方法如下: ① 将载体放在含肥皂的水中煮沸30min ; ②而后以自来水洗净; ③用蒸馏水煮沸10min ; ④用蒸馏水漂洗至pH呈中性; ⑤晾干(或熨平) 备用。载体经压力蒸汽灭菌后,统一使用滴染法。中和剂的筛选在本次试验中尤为关键,在进行消毒试验时,需要某种化合物可作为中和剂用来终止消毒剂杀菌作用,以便能准确获得消毒剂在一定时间内的杀菌结果。这些有机或无机化合物与消毒剂作用后不仅能及时终止消毒剂的杀灭微生物作用,且这些化合物本身及其与消毒剂的反应产物对微生物无抑制或杀灭作用,对培养基亦无不良影响。常见的中和剂成分有甘氨酸、卵磷酯和吐温280 ,它们均属两性活性剂,可与多种非离子活性物质有良好的相溶性,有抗氧化作用,是一种清除非离子活性物的试剂。含碘剂的消毒液中的游离碘对细菌的沉淀蛋白和卤化作用,达到杀菌目的。

硫代硫酸钠易与卤素反应生成硫酸,在碱性液中溶解呈强还原性,可有效去除碘的杀菌力,是良好的中和剂。《消毒技术规范》对使用中消毒液染菌量检测,没有详尽说明各种消毒剂的中和剂成分,按常规配制的中和剂其结果不一定理想,因此在开始本试验之前做一个中和剂的筛选试验显得尤为重要。